1分钟前 植物染色体原位杂交技术服务承诺守信「科锐诺」[科锐诺44070b2]内容：

原理

原位杂交技术是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。

经特定标记的核苷酸链为探针，可与组织切片、细胞或染色体标本中的待检DNA片段或mRNA进行杂交，然后显示标记物，从而分析待检核酸的分布和含量。利用此项技术可研究各种基因在染色体上的定位，编码某种蛋白质的mRNA在胞质中的表达。

意义

在研究DNA分子原理的基础上发展起来的一种技术。其基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，能过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子的特点，应用带有标记的（有性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、等非性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DNA 的存在并定位；用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。

应用于分子病理诊断的DNA测序技术有直接测序法和焦磷酸测序法。直接测序技术主要是Sanger等发明的双脱氧链末端终止法。其原理就是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G4组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。直接测序法是基因突变检测的“金标准”，其优点是结果准确，重复性好，可检测整个测序范围内已知和未知突变点;缺点是步骤多，耗时长，灵敏度低，过程不易控制，在检测已知突变位点方面将逐渐被荧光定量PCＲ法替代。

荧光原位杂交技（fish）原理：是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。

荧光原位杂交技（fish）实验步骤：

1、组织固定：组织取出洗净后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。

2、脱水：组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋。

3、切片：石蜡经切片机切片，摊片机捞片，62°烤箱烤片2h。

4、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲1苯Ⅰ 15min-二甲1苯Ⅱ 15min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min，风干，DEPC水浸泡。

5、消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10分钟，自然冷却。后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。